本发明提供了在血液学装置中使用的新鲜人血小板的新的类似物。还描述了制备这种类似物的方法。
1.在自动化血细胞分析仪中用作参考对照的人血小板类似物的制备方法,所述方法包括以下步骤:(a)通过从非人脊椎动物的红细胞中引出细胞液而使所述红细胞收缩至人血小板的尺寸;和(b)将来自步骤(a)的细胞在至少50°C的温度下加热至少1天的时间,其中在加热之前或加热的同时用变性剂处理所述细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其中步骤(a)还包括在细胞收缩之后,将细胞在约40°C下加热0.5至5小时。
3.如权利要求1所述的方法,其中步骤(a)还包括在细胞收缩之后,将细胞在约40°C下加热约3小时。
4.如权利要求1所述的方法,其中步骤(b)包括用变性剂处理来自步骤(a)的细胞至少2小时,然后在所述加热之前,从细胞去除所述变性剂。
5.如权利要求1所述的方法,还包括步骤(c):用固定剂对来自步骤(b)的细胞进行固定。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述固定剂是戊二醛。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述红细胞是山羊红细胞。
8.如权利要求1所述的方法,其中步骤(b)中的加热在50°C至75°C下进行。
9.如权利要求8所述的方法,其中步骤(b)中的加热在约56°C下进行。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为至少2天。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为至少3天。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为至少4天。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为至少7天。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为至少14天。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述时间为约21天。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述变性剂是α-萘酚。
17.如权利要求16所述的方法,其中α-萘酚的浓度为100g/L-500g/L。
18.如权利要求16所述的方法,其中α-萘酚的浓度为至少400g/L。
19.如权利要求16所述的方法,其中α-萘酚的浓度为至少500g/L。
20.如权利要求16所述的方法,其中所述时间为至少7天且α-萘酚的浓度为至少400g/L。
21.如权利要求16所述的方法,其中所述时间为至少14天且α-萘酚的浓度为至少400g/L。
22.如权利要求16所述的方法,其中所述时间为至少21天且α-萘酚的浓度为至少400g/L。
23.如权利要求16所述的方法,其中所述时间为约21天且α-萘酚的浓度为约500g/L。
24.通过权利要求1所述的方法制备的在自动化血细胞分析仪中用作参考对照的修饰的红细胞。发明背景本发明涉及的领域为血液学装置的参考和对照材料,尤其涉及用作自动化血小板计数的对照的模拟人血小板。自动化血细胞分析仪为血液样品中存在的不同类型的细胞中的每一种提供细胞计数,其工作是通过测量每一细胞类型的电学和/或光学性质来实现的。这些性质包括电阻抗、电导性、射频调节、光散射和光吸收的不同组合。多种分析仪都可以买到并用在临床实验室中,各种分析仪在收集和处理数据的方式上有所不同。联邦法规要求定期用对照来检查血细胞分析仪以确保分析仪的可靠性。所述对照是合成的悬浮液,其具有与血液相似的某些物理和化学性质,并且包含尺寸和形状与人血液中存在的不同细胞十分接近的稳定的细胞或颗粒。遗憾的是,不同装置中的不同方法以不同的方式与对照发生反应,并且作为具体装置的一种细胞的有效替代物的某些对照颗粒类型已被发现似乎与不同装置的另一类型细胞或甚至细胞碎片类似。在对照中必需提供的人血液的各种细胞类型中,血小板带来最多问题。实际的血小板不适宜在对照中使用,因为当血小板悬浮于的血液离开血管系统时,血小板会破裂,并且该破裂能释放促凝血酶原激酶,促凝血酶原激酶能引起凝血。此外,血小板易被活化且易聚集。而且它们的价格昂贵。由于这些原因,开发出了模拟血小板,它们价格便宜且没有这些不利特征。模拟血小板通常是生物学细胞或非生物学颗粒。当使用生物学细胞时,它们是经修饰具有下述性质的非血小板细胞:这些细胞能用与实际血小板相同的参数进行检测,并且因而可与其它细胞类型相区别。当使用颗粒时,它们是具有这些性质的颗粒。所述性质因检测方法而异。在某些情况下,区别特征是尺寸范围和尺寸分布,而在其它情况下,区别特征是化学内容物,例如与红细胞中存在血红蛋白相比缺少血红蛋白。为了使对照能在不同类型的装置而非仅仅一种装置中使用,重要的是无论使用什么样的装置方法都能将模拟血小板组分检测为血小板。遗憾的是,并非情况总是这样,即便测量的性质是尺寸分布时,即,对于具体的对照,通过一种检测方式具有一种尺寸分布而通过不同的检测方式具有另一种尺寸分布并非罕见。新鲜的人血小板具有对数正态尺寸分布而非高斯分布,并且依赖颗粒尺寸的检测装置也必需具有对数正态分布的对照或具有可以接受接近对数正态尺寸分布的群体的计算机算法。缺乏人血小板的破裂和聚集性质的实际的人血小板的相对便宜的替代物是来自非人脊椎动物的红细胞。为了使这些细胞能作为模拟血小板使用,缩小细胞的尺寸并用固定剂处理而使细胞膜硬化。山羊是作为血小板替代物的红细胞的良好来源,因为可对山羊红细胞进行改变或者混合,使其与人血小板的尺寸及尺寸分布相似。调整尺寸的一种方法是将细胞悬浮在高渗溶液中,从而利用渗透压将细胞液从细胞压出。可在使用渗透压之前或之后进行固定处理,这取决于是否将固定处理用作施加渗透压时控制或限制细胞液通过速率的手段。当进行固定处理来控制液体通过细胞膜的速率时,其目的是实现需要的颗粒尺寸范围和尺寸分布。然而,即使能达到通过光学技术所检测的特定颗粒尺寸范围和分布,但是通过电学技术检测时的尺寸范围和分布未必相同。2001年4月16日发布的美国专利第5,008,201号(Ryan,W.L.(Streckxa0Laboratories,Inc.))公开了改正该缺陷的一种方法。该方法涉及通过以下方式制备梯度系列的颗粒尺寸:将不同细胞群体进行不同程度的固定,从而使每一细胞群体施加渗透压时收缩不同的程度。然后,将细胞群体按照能共同接近期望的尺寸分布的比例混合。这方法的工作量较大,且易受所选的比例和不同处理程度中的标志的影响。已经发现,可以从已经在尺寸上缩小并随后进行了固定的非人脊椎动物红细胞来制备血小板类似物,对于这种血小板类似物,通过光学测量所检测到的尺寸范围和分布与通过电学测量所检测到的尺寸范围和分布十分接近。该制备方法涉及首先将尺寸缩小并经过固定的细胞加热到室温以上并持续足以在细胞上产生变性效果的时间,然后优选在将细胞冷却至室温或接近室温之前或之后,将细胞暴露于固定剂。在不需要单独制备不同批的具有不同尺寸的细胞,并将各批细胞以仔细选择的比例混合来形成接近所需尺寸分布的混合物的情况下,即可获得该方法的有效结果。也可以对单批细胞进行该方法,并仍可以实现电学和光学测量方式所能检测到的期望分布。这种制备方法使尺寸和分布特征更接近于能使收缩细胞作为评价实际人血小板的对照的尺寸和分布特征。美国专利第4,179,398号和美国专利申请公开第2006/0223187号描述了利用山羊红细胞作为起始材料来制备人血小板类似物的方法。本发明提供了制备具有更理想的特征的模拟人血小板的新方法,所述更理想的特征例如改进的光学特征和使光学和电学测量之间的尺寸范围和分布结果更加一致。发明概述一方面,本发明涉及用作自动化血细胞分析仪中的参考对照的人血小板类似物的制备方法。所述方法包括以下步骤:(a)通过从非人脊椎动物的红细胞引出细胞液而使所述红细胞收缩至人血小板的尺寸;和(b)将来自步骤(a)的细胞在至少50°C下加热至少1天。在某些实施方案中,所述方法的步骤(a)还包括在细胞收缩之后,将所述细胞在约40°C下加热约0.5至约5小时,例如约3小时。在其它的实施方案中,在存在变性剂的条件下进行所述方法的步骤(b);或者步骤(b)还可以包括用变性剂处理来自步骤(a)的细胞至少2小时,然后在进行步骤(b)中的加热之前,从所述细胞去除变性剂。在某些实施方案中,所述方法还包括步骤(c):用固定剂对来自步骤(b)的细胞进行固定。示例性的固定剂是戊二醛。在其它的实施方案中,所述红细胞是山羊红细胞。在某些实施方案中,步骤(b)中的加热是在约50°C至约75°C,例如在约56°C下进行。在某些实施方案中,步骤(b)中的加热时间为至少2天、3天、4天、7天、14天或21天。在其它的实施方案中,所述变性剂是α-萘酚,并且α-萘酚的浓度可以为约100g/L-约500g/L、或至少400g/L、或至少500g/L。在某些实施方案中,加热时间为至少7天且α-萘酚浓度为至少400g/L;或者加热时间为至少14天且α-萘酚浓度为至少400g/L;或者加热时间为至少21天且α-萘酚浓度为至少400g/L;或者加热时间为约21天且α-萘酚浓度为约500g/L。另一方面,本发明涉及通过以上段落所描述的任一方法且尤其是权利要求1-25中的任一项所述的方法而制备的用作自动化血细胞分析仪中的参考对照的修饰的红细胞。附图简要说明图1:在Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置上进行的新鲜血液分析。图2:在Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置上进行的血小板类似物浓缩物分析,所述血小板类似物浓缩物是用210g/Lxa0α-萘酚(未加热,无戊二醛)制备的。图3:在Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置上进行的血小板类似物浓缩物分析,所述血小板类似物浓缩物是用210g/Lxa0α-萘酚(于56°C下加热1天,然后用戊二醛处理)制备的。图4:在Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置上进行的血小板类似物浓缩物分析,所述血小板类似物浓缩物是用210g/Lxa0α-萘酚(于56°C下加热2天,无戊二醛)制备的。图5:利用Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置分析α-萘酚(100-500g/L)和加热处理(56°C下加热1-21天)对PIC/POC%的影响。图6:在Abbottxa0Cell-Dynxa0CD4000血液学装置上进行的血小板类似物浓缩物分析,所述血小板类似物浓缩物是用450g/Lxa0α-萘酚(于56°C下加热3天,无戊二醛)制备的。发明的详细描述I.引言本发明人发现,通过将红细胞在提高的温度下长时间加热并联合使用变性剂(诸如α-萘酚)对制备血小板类似物(例如收缩至期望尺寸并优选进行固定的非人红细胞)的常规方法进行改进,可以提高所述类似物的光学性能,使得可以在光学手段和电学手段之间实现一致的结果,这使得所述类似物能更好地用作血液学装置中的对照。II.起始材料本发明组合物的起始材料可以是来自诸如山羊或任何常见山羊物种的非人脊椎动物的全血。因为无需考虑任何具体抗原或抗原组,例如偶尔存在于人血小板组分中的肝炎相关抗原,因此不需要采取预防措施。山羊红细胞的体积和尺寸分布范围随年龄、性别、遗传因素、繁殖史、代谢状态和山羊饲养方式和环境而在一定程度上变化。然而,山羊红细胞的平均红细胞体积通常为人血小板平均血小板体积的2-3倍,直径通常为约4.1微米,体积为约35立方微米。III.沉淀步骤将来自非人脊椎动物(例如山羊)的全血的红细胞优先进行沉淀,即,通过本领域内已知的各种方法使红细胞以快于其它血细胞成分的速率进行沉降,例如通过将血液与含有聚合糖、二羧酸盐和弱碱的溶液混合或通过离心方法。举例来说,聚合糖是聚合的葡糖酐或者正如本领域所公知的葡聚糖,其分子量为约100,000至约500,000,或约150,000至约200,000。另一种可能的聚合糖是分子量为500,000的聚合蔗糖。聚合糖的浓度可以为每升约20至约50克,例如每升约30克。二羧酸盐可以是任何常见的盐,例如碱金属盐,而二羧酸可以是能有效促进红细胞沉淀的任何酸。例如,所述酸是草酸或酒石酸。常使用酒石酸的二碱金属盐,因为它倾向于赋予细胞球形的形状。弱碱可以任何常见的弱碱,例如氨水、磷酸一碱金属盐或磷酸二碱金属盐或碳酸氢盐。例如,所述弱碱为碳酸氢钠。二羧酸盐和弱碱的浓度应足以为沉淀溶液提供约6.0-约8.5的pH范围,最优选为约6.5-约7.5的pH范围。已经发现,沉淀步骤是反向pH依赖性的;即,pH越低,沉淀速率越快。各种离心方法也是从非人脊椎动物的全血样品沉淀红细胞的有效且方便的手段。用于该特定目的的多种离心装置和完善方案都可以商购获得。应当理解,上文所示的沉淀溶液的组分的类型和浓度有多种可能的变化,这对本领域技术人员是显而易见的,仅有的限制因素是能够防止红细胞的过度联合和溶血。IV.收缩步骤通过将沉淀步骤中沉淀的红细胞悬浮于一系列水性高渗盐溶液中,可引出红细胞细胞液并收缩。由于细胞在高渗溶液或溶质的浓度高于细胞中溶质的浓度的溶液中收缩的原理很简单,因此显而易见的是,任何盐都可以作为本发明该步骤中的溶质,只要它不会引起过度溶血或细胞联合。添加具有分散作用的试剂是可取的,因为它能帮助防止过度细胞联合。合适的分散剂是萘酚-二磺酸的二碱金属盐和低分子量(小于42,000)的葡聚糖。本领域技术人员还应当意识到,如果本发明的组合物用在电子血小板计数器中,关于盐的选择还有一些潜在限制因素,应当考虑到液态悬浮液的相对电导率/电阻以及任何可能的不利电解效应。特别合适的用于收缩步骤的盐类是萘酚-二磺酸的二碱金属盐,这是由于它们能起到分散剂和收缩剂的双重作用,例如2-萘酚-6,8二磺酸的二钾盐和2-萘酚-3,6二磺酸的二钠盐。通过将沉淀的红细胞(例如山羊红细胞)相继悬浮于盐浓度渐增的水性溶液中直到达到所需的尺寸范围来使红细胞收缩。由于人血小板的直径为约1.8-约3.6微米,体积为约5-约25立方微米,因此这是期望的尺寸范围。人体中正常的血小板计数为每立方毫米约200,000-约400,000,而低的计数可少至每立方毫米75,000。因此,期望的细胞群体或密度为每立方毫米约75,000-约400,000个细胞。在整个过程中,将盐溶液的浓度保持为等于或大于前一溶液的浓度是重要的,以便维持高渗性并防止任何细胞膨胀。高渗溶液中盐的有效终浓度应该为每升约650-约700毫当量,优选约680毫当量。通过多次添加升高浓度的溶液可以实现这一点,仅有的限制因素是实际的次数和保持溶液中的盐不析出。关于后一问题,已经发现使用等份的萘酚二磺酸的二钾盐和二钠盐是特别有效的。在本发明的优选实施方案中,将细胞相继悬浮于浓度渐增的三种高渗水性溶液中,第一种溶液的浓度为每升约100-约300毫当量,优选每升200毫当量,第二种溶液的浓度为第一种溶液浓度的二倍,第三种溶液的浓度为第二种溶液浓度的二倍。通过每次向上一次残余的悬浮液添加三倍体积的高渗溶液,可使有效的终浓度位于优选的范围内。每次悬浮以后,沉淀细胞,并弃去上清。通过每次悬浮以后的离心,可以大大加速收缩过程。每步离心合适的速度范围为1,000-3,000g,时间范围为约10-20分钟,优选15分钟。当细胞收缩至期望的尺寸时,可以将它们重悬于作为最终收缩溶液的相同浓度的新鲜溶液中,准备用于任选的固定步骤或直接用于变性步骤。制备山羊红细胞使之具有人血小板的尺寸范围的方法是本领域内已知的。这些方法中包括上文指出的通过渗透压从红细胞引出受控量的细胞液,并如同样上文所指出的,联合利用固定剂固定所述细胞。在某些情况下还用到其它处理和处理剂,例如包括抗凝血剂和稳定剂,并且在某些情况下,在引出细胞液之后,利用加热使细胞退火(anneal)。所有这些处理,无论怎样组合以及以什么顺序进行,制备的红细胞都用于组成本发明的加工步骤。在按照本发明加工之前,红细胞的尺寸范围(本文中用术语“平均血小板体积”表示)可以不同,尽管所述红细胞是血小板类似物而不是实际的血小板。在大多数情况下,所获得的最佳结果的尺寸范围为约5飞升-约15飞升,优选约5飞升-约10飞升,并且最优选约7飞升-约9飞升。任选地,在红细胞收缩之后,可以另外进行短暂的加热步骤。具体而言,将收缩的细胞置于温度适当高于室温(例如,40°C)的环境中,持续相对短的时间(例如,0.5-5小时,例如3小时)。该步骤的作用是使细胞膜再退火。V.变性步骤按照本发明,然后通过长时间加热使预处理的红细胞(即,已经收缩并且任选地经过短暂加热(例如40°C下加热3小时)的红细胞)变性,以进一步提高它们的光学性质,并使之更好地“适合”检测过程中的光学通道。本发明实践中的变性步骤包括在存在或不存在变性剂(例如,α-萘酚)的条件下,将尺寸缩小的红细胞加热至足够的温度并保持足够的时间,以实现变性效果。该热处理应当达到足够的程度和时间来获得该效果,而不会损伤细胞或使细胞凝聚。温度可以随着细胞在该温度下保持的时间的长度而变化。在大多数情况下,通过加热至约50°C或更高的温度,优选约50°C-约75°C,最优选约50°C-约60°C来获得处理时间方面最有效的结果。足够的加热处理时间可以随着以下因素而变化,包括:温度和处理细胞用的变性剂是否存在及其浓度。例如,当使用较高的温度或使用较高浓度的诸如α-萘酚的变性剂时,即便应用较短的加热时间也能获得相同的变性效果。本申请所使用的能实现所需的变性效果或能提高加热的变性效果的任何化学品都可被用作变性剂。在某些示例性的实施方案中,用于本发明的变性剂是萘酚或具有下文提供的式(I)或(II)的萘酚衍生物。如后文部分的实施例中所描述,随后,将已收缩至期望尺寸(并然后优选经过短暂的温和加热处理)的预处理的红细胞(也被称为再退火的膜)在升高的温度下加热一段时间,所述加热的时间足以使细胞蛋白变性并提高细胞的光学性质,尤其是使通过光学测量和电阻抗测量得到的尺寸范围/分布之间的结果获得高水平的一致,以便降低或消除自动化血液学装置上的标志信号,例如,Abbottxa0Cell-Dynxa04000血液学装置上的PIC-POC标志,其表示阻抗系统计数(PIC)和光学系统计数(POC)间的差异超过20%。所述升高的温度通常为50-75°C,例如,56°C。加热时间通常为至少24小时,并且可以为至少48、72、96、120、168、336或504小时。在某些情况下,甚至可以进行更长的时间的加热。在恒温环境下(例如水浴)进行所述加热步骤。在某些情况下,可以在存在变性剂的条件下进行修饰非人红细胞的过程,从而进一步提高加热的效果或通过较短时间的加热过程获得相同的变性效果。例如,萘酚可以充当变性剂,包括α-萘酚和β-萘酚。其它萘酚衍生物也可用作本方法中的变性剂。这些萘酚衍生物具有式(I)或(II):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷每一个都独立地选自-H、烷基、芳香基、烷氧基、-OH、-NH₂、烷基-NH-、芳香基-NH-、卤素、磺基、-C(O)H、烷基-C(O)-、烷基-SO₂NH-、芳香基-SO₂NH-、-NO₂、-NO、-COOH、-COO-烷基、-CN或-C(O)NH-烷基。在具有式(I)的α-萘酚衍生物的某些实施方案中,R¹、R²和R³每一个都独立地选自烷基、芳香基、-OH、-NH₂、烷基NH--、卤素、磺基、-C(O)H、烷基-C(O)-、-NO₂、-NO、-COOH或-COO-烷基。在某些情况下,R⁴、R⁵、R⁶和R⁷每一个都独立地选自-H、-OH、-NH₂、磺基、卤素、-CN、-COOH或-COO-烷基。在具有式(I)的α-萘酚衍生物的其它实施方案中,R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷每一个都独立地选自-OH、-NH₂、-Ph、-SO₃H、-Br、-Cl、-F、-C(O)H、-C(O)CH₃、-NO₂、-NO、-COOH、-C(O)OCH₃R¹、-SO₂NH-烷基、-OCH₃、-CN、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳香基、烷基-NH-或芳香基-NH-。在某些情况下,R¹、R²和R³每一个都独立地选自-OH、-NH₂、-Ph、-SO₃H、-Br、-Cl、-F、-C(O)H、-C(O)CH₃、-NO₂、-NO、-COOH或-C(O)OCH₃。在一种情况下,R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷是-F。可用在本发明中的商购α-萘酚衍生物的实例包括但不限于,4-氯代-1-萘酚、1,5-二羟基萘、1,7-二羟基萘、1-甲氧基-4-硝基萘、4-氟磺酰-1-羟基-2-萘甲酸、1,3-二羟基萘、4-甲氧基-1-萘甲腈、2-硝基-1-萘酚、4-甲氧基-1-萘酚、2-乙酰基-1-萘酚、9-菲酚、1-萘酚-3,6-二磺酸二钠盐水合物、α-羟基-七氟萘、5-氨基-1-萘酚、N-(2-乙酰氨基苯乙基)-1-羟基-2-萘酰胺、8-氨基-1-萘酚-3,6-二磺酸或其一钠盐一水合物、8-氨基-1-萘酚-5-磺酸、变色酸或其盐、2,4-二氯代-1-萘酚、1-萘酚-2-磺酸或其钾盐、1-萘酚-4-磺酸或其盐、1,7-二羟基萘、4-氨磺基-1-羟基-2-萘甲酸、5-羟基-1-萘磺胺、6-氨基-1-萘酚、2-(2-羟基-1,1,1,3,3,3-六氟丙基)-1-萘酚、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1,4-二羟基-2-萘甲酸苯酯、1,6-二羟基萘、4-羟基-1-萘甲醛、7-苯胺基-1-萘酚-3-磺酸、6-氨基-1-萘酚-3-磺酸、4-硝基-1-萘酚、4-羟基-6,7-二(甲氧基羰基)-1-萘酚、2,4,6,8-四硝基-5-羟基-1-萘酚、4,6-二亚硝基-5-羟基-1-萘酚、4,6-二氨基-5-羟基-1-萘酚、2,2′-联苯基-1,1′-二醇、2,3-二(甲氧基羰基)-1-萘酚、2-乙酰基-3-丁基-1-萘酚、3-苯基-1-萘酚、1-萘酚-8-磺酸或其盐、3-氯代-1,4-二羟基萘、1-氨基-5-萘酚-7-磺酸、2-氟代-1-萘酚、3,5-二羟基-2-萘甲酸、1-萘酚-3-磺酸或其盐、2,4-二溴-1-萘酚、6-氨基-1-萘酚、2-氨基-1-萘酚盐酸盐、2,3-二氰基-1,4-二羟基-5-硝基萘、1,2-二羟基萘、1-羟基-2-萘甲醛、4-苯磺酰氨基-1-萘酚、2-(4-苯磺酰基)-4-(4-氯代苯磺酰氨基)1-萘酚本和4-乙酰氨基-1-萘酚。变性剂的浓度可以根据试剂的性质以及加热步骤中所用的时间和温度而变化。通常,浓度为约100g/L-约500g/L。在备选方案中,可以用变性剂(例如α-萘酚)将收缩的红细胞处理足够的时间(例如,至少2小时)而无需加热(例如,室温下)。去除变性剂之后,按上述对细胞进行加热处理,例如,在50-75°C的升高的温度,例如56°C,处理至少24小时,在某些情况下处理至少48、72、96、120、168、336或504小时,或处理更长的时间。在该处理方案中,变性剂的浓度还可以为约100g/L-约500g/L。VI.固定步骤对收缩的和变性的/加热的红细胞进行固定是本发明中任选的步骤。换言之,按照本发明经上述过程处理的红细胞可以直接用作血液学装置中的血小板类似物,而无需利用固定剂进行固定的步骤。任选地,可以用诸如戊二醛的固定剂进一步处理收缩和变性/加热步骤之后所获得的红细胞,从而使细胞膜硬化和防止它们生物降解。同样,能实现该效果的任何化学品都可以用作本方法的固定剂。例如,通过使细胞悬液与诸如甲醛或戊二醛的有机醛溶液接触来进行预处理的红细胞的固定。所添加的醛的浓度以重量计可以为约5%-约50%,只要其终浓度的范围以重量计为约0.5%-约1.0%,优选约0.6%。同沉淀和收缩溶液一样,在选择合适的固定剂(例如,醛)及其浓度上仅有的实际的限制因素是消除过度细胞联合和溶血以及潜在的不需要的电解效应。在一个实施方案中,将以重量计50%浓度以下的戊二醛缓慢滴入细胞的高渗悬液中,同时快速搅拌。由于添加的固定溶液稀释了高渗悬液。因此应当添加足量的高渗收缩溶液,以使其浓度维持在相同水平,并因此保持收缩的细胞的尺寸。此后,允许固定的细胞静置、分离、用缓冲溶液洗涤、并将其置于贮存溶液中。作为恢复收缩的细胞之前的任选步骤,为了确保高质量的产物仅含有最硬的细胞的稳定细胞群体,可以通过任何合适的方法(例如声波式搅拌)对细胞悬液进行剧烈的搅拌。该步骤往往能破坏膜较弱的细胞,因此留下更硬的细胞用作血小板计数的参考对照。缓冲洗涤溶液应当是中性至碱性的,pH优选为约7.0-约10.0。尽管可以使用任何缓冲溶液,但是在考虑到上文指出的溶血、细胞联合和电解效应的问题的情况下,优选的缓冲试剂组合包括氢氧化钠、碳酸氢钠和氯化钠。应当用缓冲溶液按需要的次数来洗涤收缩的细胞,以获得澄清的上清,优选洗涤至少三次。用于悬浮细胞的贮存溶液几乎可以为任何溶液(包括仅用水),但是该溶液不应对固定的细胞具有不利效应,例如引起溶血、细胞联合或生物降解。优选的贮存溶液基本上与洗涤步骤中所用的缓冲溶液一样,但添加了用于防止污染的杀菌剂或抑菌剂以及分散剂。所述杀菌剂或抑菌剂可以是任何已知的试剂,所添加的浓度应足以降低或抑制细菌生长。便宜且优选的杀菌剂/抑菌剂是庆大霉素和/或Proclinxa0150。另一种杀菌剂/抑菌剂是四环素的盐酸盐。每种杀菌剂/抑菌剂的添加浓度可以为每升约0.1克。分散剂可以是一种萘酚-磺酸的二碱金属盐或低分子量的葡聚糖。优选的分散剂是分子量为约20,000-约41,000、优选约40,000的葡聚糖,所添加的浓度为每升约30克。如果使用萘酚-磺酸的二碱金属盐,例如2-萘酚6,8-二磺酸二钾盐,那么优选的浓度为约0.02-约0.05M,优选约0.04M。如果血小板参考对照用于电子血小板计数装置,则为了增强电导率,贮存液中优选含有电解质。然而,这类应用中溶液的pH应该基本上是中性至碱性的,并且可以兼作电解质的缓冲体系能有利地用于维持溶液的pH。可以通过任何已知的稀释或浓缩技术来调整细胞群体或密度。例如,如果产物的密度为每立方毫米300,000个细胞,而所需的密度为约75,000,那么应该通过添加三倍体积的稀释液来稀释液体悬浮液,从而获得所需的密度。在实施所有上述步骤中,为了确保产物的高纯度,优选使用试剂纯的化学品,而不是工业纯的。还优选预防细胞粘附到玻璃器皿上,这是细胞的自然趋势。实现这点的标准措施是将待使用的所有玻璃器皿进行“硅化处理”,该过程是通过用四甲基硅烷的苯溶液包被玻璃器皿,并使将包被的玻璃器皿置于100°C下(干空气),持续15-30分钟。VII.配制步骤收缩步骤、变性/加热步骤和任选的固定步骤之后,可以将红细胞悬浮于多种液体中,包括低渗液、等渗液和高渗液。优选等渗水性溶液,即不会形成跨细胞膜的渗透压差异的溶液,因为它们与最终的血液对照产物最相容。可以添加常规的添加剂,它们所起的作用与它们在现有技术的标准细胞悬浮液中所起的作用相同。例如,可以添加丙二醇以任选澄清细胞质和减少细胞与细胞的结合。在本发明的某些实施方案中,在进行本发明的加热和固定步骤之前,对细胞进行预处理。通过以下来进行预处理:通过在低于以上所列举的温度范围的温度下将细胞进行温和加热,持续至少1小时,并优选用等渗稀释液、盐溶液稀释液或水稀释后进行加热,并且在某些情况下,与溶解在任何这些介质中丙二醇一起加热。优选的预处理温度为约30°C-约40°C,并且预处理时间为约2小时-约4小时。预处理往往会提高光学和电学血小板计数的一致性。除了以上所讨论的处理步骤之外,通过将细胞在人红细胞悬液中孵育来实现光学和电学血小板计数法之间一致性的进一步提高。所述孵育优选在室温下进行至少一天,更优选至少5天,最优选至少10天。实施例仅以举例说明而非限制的方式提供以下实施例。本领域技术人员应当容易地意识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。实施例1:对预处理的红细胞的加热与新鲜的血液(图1)相比,用于Abbottxa0CD4000和Sapphire装置(此后称为“Hem-Au”)的具有目前再退火的膜的实验血液对照制剂具有良好的血小板阻抗计数精度,但是光学计数精确差(图2)。与光学计数相比,通常平均阻抗计数较高,这导致容易出现PIC/POC标志;当平均阻抗计数(PIC)与血小板光学计数(POC)明显不同时,出现该标志。所用的目前的再退火的膜不能正确地适合于CD4000和Sapphire血液学装置的光学通道。在以前的研究和未决专利申请(图3:美国专利申请公开号2006/0223187)中,已经证实,用戊二醛处理完成再退火的膜并于56°C加热24小时能使再退火的膜更好地“适合”CD4000上的光学血小板通道。该未决专利中的方法允许血小板类似物具有良好的血小板阻抗计数(PIC)精度和良好的血小板光学计数(POC)精度。然而,Abbottxa0CD4000装置会给出多个PIC/POC病态标志来表明所评价的血小板类似物与新鲜血液不同。此外,与血小板类似物相联的游离醛基干扰CD4000的WBC通道上的荧光。该实施例表明,仅延长变性加热会改变完成再退火的膜的形状,并因此帮助它们更好地“适合”光学血小板通道。一旦血小板能更好地适合,PIC/POC标志的出现会较少。材料:●再退火的膜;●用于配制血液对照的相容介质中的加工过的人红细胞;●低渗盐溶液,如具有有机缓冲液的Frog林格氏液(即改良林格氏液或M-林格氏液);●用作配制血液对照中的稀释液的悬浮介质;●1mL无菌移液管;●15ml离心管;●2.5ml的小瓶和盖;●Abbottxa0CDxa01700、CD3500和CD4000血液学分析仪;●水浴。方法:1.加热再退火的膜(56°C下加热4天)a.将10ml再退火的膜倒进1个15ml的离心管中。b.将管置于56°C的水浴中。2.洗涤加热过的再退火的膜a.取出加热过的再退火的膜。b.将管全速(3600rpm)离心15分钟。c.吸取并弃掉上清。d.用林格氏液将管添至14ml的刻度。e.再重复步骤2b-2d三次。f.重悬于M-林格氏液中至约25.9×10⁶的计数。3.配制样品a.将处理过的人红细胞浓缩至约4.50×10⁶的正常计数。b.利用人红细胞制备低浓度、标准浓度和高浓度的血小板样品。c.在CD4000上对所有三个水平进行精度研究。d.在CD1700和CD3500上运行其它样品。e.将样品保存于2-8°C。4.结果●加热的再退火的膜良好地适合CD4000上的光学血小板通道。当将它们加进低血小板浓度和正常血小板浓度的处理过的人红细胞中时,未出现PIC/POC标志。●PLTo和PLTi的所有三个水平上的CV%都在Cell-Dynxa04000的精度限以内。●当在CD4000上运行样品时,未出现血小板、白细胞或红细胞标志。样品也能用于其它阻抗计数仪,例如Abbottxa0CD1700和CD3500。实施例2加热之前萘酚对山羊红细胞的作用目的:目的是确定处理血细胞中所用的α-萘酚的量是否与56°C下加热α-萘酚处理的细胞以消除Abbottxa0CD4000装置上的PIC/POC标志所需的时间量反向相关。设备:●Abbottxa0CD4000血液学分析仪,S/Nxa030380AA●VWR水浴,型号89032-218,S/Nxa0WL0713029●VWR离心机,Clinicalxa050,S/Nxa0F703069,于2007年10月15日校准。材料:●山羊红细胞●用于配制萘酚溶液的去离子水●用于配制血液对照的红细胞悬浮介质中的处理过的人红细胞,●试剂戊二醛-pHxa07.00●具有有机缓冲液的Frog林格氏液●0.9%NaCl(等渗盐溶液)●用作配制血液对照中的稀释液的悬浮介质●125mL玻璃瓶和盖●1mL无菌移液管●15mL离心管●2.5mL的小瓶和盖步骤:再退火的膜1)在低渗环境中温和裂解山羊红细胞。2)使膜在约40°C下退火约3小时。3)在100、200、300、400或500g/L的α-萘酚中悬浮2小时。4)用0.3%的戊二醛进行稳定化处理。5)在等渗平衡的盐溶液中洗涤。加热再退火的膜1)将75ml的每种再退火的膜[系列1(100g/L)、系列2(200g/L-母液)、系列3(300g/L)、系列4(400g/L和系列5(500g/L)]倒进无菌的125ml玻璃瓶中,并置于56°C的水浴中。2)30分钟后,将瓶摇动以重悬血小板并使热量均匀分布。3)移出样品(见表1)。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="562"/>洗涤加热24小时至504小时的再退火的膜1)将2mL样品加入15mL的管中。2)用M-林格氏液将管添至14.5mL并重悬。3)将管于3600rpm离心15分钟。4)吸取并弃掉上清。5)再重复洗涤三次。6)用悬浮介质填充管,并重悬浮颗粒。7)将管于3600rpm离心10分钟。8)再洗涤两次,并调整至20-30×10⁶的计数。配制样品1)将经加热/洗涤的血小板加入人RBC成分中至近似正常的血小板计数(~250×10³)。2)在CD4000上运行。结果:●需要增加α-萘酚的浓度来产生在CD4000上运行时不恢复PIC/POC标志的血小板类似物。●α-萘酚浓度的变化改变了血小板类似物的光学性质,使得Cell-Dyn4000能够通过光学法和阻抗法相同地计数血小板。●使用的α-萘酚的浓度越高,MPV越小。●血小板类似物被加热的越久,MPV越小。加热血小板类似物的时间不超过必需的时间是比较有利的,因为如果没有正确校正血小板获取设置,某些装置很难对小的血小板类似物进行精确计数。●所用的α-萘酚的浓度与加热(56°C)所需的时间存在相关性。●当α-萘酚浓度增加与延长56°C下的加热时间联合使用时,能提高阻抗和光学血小板计数的CV%。还减少PIC/POC标志的发生。讨论:●标准现有血小板类似物(图2)在较新的技术装置(CD4000和CDxa0Sapphire)的光学计数系统中不能被完全计数。这导致当与更可靠的阻抗计数方法相比时较高的不精确性。化学品1-萘酚-3,6-二磺酸(下文称为α-萘酚)用在血小板类似物的制备中,并且根据原材料的水含量,所用的浓度可以在批次之间变化。在生产一批血小板类似物之前,成分制造核实所接到的每批新原材料的电导率。当CD4000不能以光学和阻抗模式对所有颗粒进行精确计数时,产生系统标志;这被称为PIC/POC标志。当两种计数模式间的Δ差异大于20%时,出现该标志。●α-萘酚在确定完成的类似物的基于电学和光学检测性质的尺寸和形状中起作用。实验表明,增加α-萘酚的浓度(从210g/L-360g/L)会改善血小板类似物的物理性质,使得CD4000能以光学(PLT_o)和阻抗(PLT_i)模式对所有56°C下加热2天的颗粒进行精确计数(图4和5)。●实验表明,通过增加α-萘酚的浓度(从210g/L-500g/L),56°C下加热3天的血小板类似物的光学性质得到提高,使得CD4000能以光学(PLT_o)和阻抗(PLT_i)模式对所有颗粒进行精确计数(图5)。该实验还表明,在能使血小板类似物在CD4000上正确工作的基础上,α-萘酚的浓度和56°C下所需的加热时间之间可能存在相关性。●实验表明,血小板类似物在56°C下加热的越久,MPV越小。根据最初的MPV,可能存在可以加热血小板类似物的最大时间量。只要MPV在5-12fL的规格范围内,就可以加热血小板类似物直到CD4000上不出现PIC/POC标志。●该实验表明,所用的α-萘酚的浓度越高,血小板的光学性质越好。当加热时间增加时,PIC/POC标志数随着α-萘酚浓度的增加而减少。因此,加热与α-萘酚的浓度反向相关。●为了制备当在CD4000上运行时没有PIC/POC标志的血小板类似物,较高的α-萘酚浓度(例如,最小400g/L)是可取的。应当注意到,所用的浓度可以根据α-萘酚原材料的质量而变化。当接到一批新的α-萘酚原材料时,需要对α-萘酚的浓度进行调整,从而优化使用浓度。图6显示用450g/Lxa0α-萘酚并于56°C下加热3天制备的确认批次的血小板类似物。●于56°C下加热血小板类似物直到在CD4000上以220×10³-270×10³的正常计数运行时不出现PIC/POC标志。通过引用将本申请中涉及的所有专利、专利申请和其它出版物(包括所公开的氨基酸或多核苷酸序列)整体并入本文,用于所有的目的。